Флуоресцентниот филтер е суштинска компонента во флуоресцентниот микроскоп.Типичен систем има три основни филтри: филтер за возбудување, филтер за емисија и двохроично огледало.Тие најчесто се пакуваат во коцка така што групата се вметнува заедно во микроскопот.
Како функционира флуоресцентниот филтер?
Филтер за возбудување
Филтрите за возбудување пренесуваат светлина со одредена бранова должина и блокираат други бранови должини.Тие може да се користат за производство на различни бои со дотерување на филтерот за да се пропушти само една боја.Филтрите за возбудување доаѓаат во два главни типа - долги филтри и флексибилни филтри.Побудувачот е обично пропусен филтер кој ги минува само брановите должини апсорбирани од флуорофорот, со што се минимизира возбудата на другите извори на флуоресценција и блокирајќи ја возбудната светлина во опсегот на емисиите на флуоресценција.Како што е прикажано со сината линија на сликата, БП е 460-495, што значи дека може да помине само низ флуоресценцијата од 460-495 nm.
Тој е поставен во патеката на осветлување на флуоресцентниот микроскоп и ги филтрира сите бранови должини на изворот на светлина, освен опсегот на возбудување на флуорофор.Минималниот пренос на филтерот ја диктира осветленоста и сјајот на сликите.Се препорачува минимум 40% пренос за кој било филтер за возбудување така што преносот е идеално >85%.Пропусниот опсег на филтерот за возбудување треба да биде целосно во опсегот на возбудување на флуорофор, така што централната бранова должина (CWL) на филтерот е што е можно поблиску до врвната бранова должина на возбудувањето на флуорофорот.Оптичката густина на филтерот за возбудување (OD) ја диктира темнината на сликата на позадината;OD е мерка за тоа колку добро филтерот ги блокира брановите должини надвор од опсегот на пренос или пропусниот опсег.Се препорачува минимум OD од 3,0, но OD од 6,0 или поголем е идеален.
Филтер за емисија
Филтрите за емисија служат за да овозможат посакуваната флуоресценција од примерокот да стигне до детекторот.Тие блокираат пократки бранови должини и имаат висок пренос за подолги бранови должини.Типот на филтерот е исто така поврзан со бројка, на пр. BA510IF на сликата (филтер за бариера за пречки), таа ознака се однесува на брановата должина на 50% од неговата максимална трансмисија.
Истите препораки за филтрите за возбудување важат за филтрите за емисија: минимален пренос, пропусен опсег, OD и CWL.Филтерот за емисија со идеална комбинација CWL, минимален пренос и OD обезбедува најсветли можни слики, со најдлабоко можно блокирање и обезбедува откривање на најслабите сигнали за емисија.
Дихроично огледало
Дихроичното огледало е поставено помеѓу филтерот за возбудување и филтерот за емисија под агол од 45° и го рефлектира возбудниот сигнал кон флуорофорот додека го пренесува сигналот за емисија кон детекторот.Идеалните дихроични филтри и разделувачи на зраци имаат остри транзиции помеѓу максималната рефлексија и максималната трансмисија, со >95% одраз за пропусниот опсег на филтерот за возбудување и пренос од >90% за пропусниот опсег на филтерот за емисија.Изберете го филтерот имајќи ја предвид пресечната бранова должина (λ) на флуорофорот, за да ја минимизирате залутаната светлина и да го максимизирате односот сигнал-шум на флуоресцентната слика.
Дихроичното огледало на оваа слика е DM505, така наречено затоа што 505 нанометри е брановата должина на 50% од максималната трансмисија за ова огледало.Кривата на пренос за ова огледало покажува висок пренос над 505 nm, голем пад на преносот лево од 505 нанометри и максимална рефлексивност лево од 505 нанометри, но сепак може да има пренос под 505 nm.
Која е разликата помеѓу филтрите за долги и пропусни филтри?
Флуоресцентните филтри може да се поделат на два вида: долг премин (LP) и бенд-пропус (BP).
Долгите филтри пренесуваат долги бранови должини и ги блокираат пократките.Крајната бранова должина е вредност на 50% од врвната трансмисија, а сите бранови должини над прекинот се пренесуваат со долгите филтри.Тие често се користат во дихроични огледала и филтри за емисија.Долгопропусните филтри треба да се користат кога апликацијата бара максимално собирање на емисиите и кога спектралната дискриминација не е пожелна или неопходна, што е генерално случај за сонди кои генерираат еден вид што емитува во примероци со релативно ниски нивоа на автофлуоресценција на позадината.
Појасните филтри пренесуваат само одредена бранова должина и блокираат други.Тие го намалуваат вкрстувањето со тоа што дозволуваат да се пренесува само најсилниот дел од емисиониот спектар на флуорофор, го намалуваат шумот на автофлуоресценција и на тој начин го подобруваат односот сигнал-шум во примероците со автофлуоресценција со висока позадина, што не можат да го понудат долгопроодните филтри.
Колку типови на комплети за флуоресцентни филтри може да обезбеди BestScope?
Некои вообичаени типови на филтри вклучуваат сини, зелени и ултравиолетови филтри.Како што е прикажано во табелата.
| Комплет филтри | Филтер за возбудување | Дихроично огледало | Филтер за бариери | LED светилка Должина на бранот | Апликација |
| B | БП460-495 | DM505 | БА510 | 485 nm | ·FITC: Метод на флуоресцентни антитела · Киселински портокал: ДНК, РНК · Аурамин: туберкулозен бацил ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Родамин, TRITC: Метод на флуоресцентни антитела ·Пропидиум јодид: ДНК · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | БА420 | 365 nm | ·Автофлуоресцентно набљудување ·DAPI: боење со ДНК · Hoechest 332528, 33342: се користи за боење на хромозомите |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Катехоламини ·5-хидрокси триптамин · Тетрациклин: скелет, заби |
| R | BP620-650 | DM660 | БА670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Алекса флуор 633, алекса флуор 647 |
Комплетовите филтри што се користат во набавките на флуоресценција се дизајнирани околу главните бранови должини што се користат во апликациите за флуоресценција, што се базира на најкористените флуорофори.Поради оваа причина, тие се именувани и по флуофорот што се наменети за снимање, како што се коцките за филтер DAPI (сина), FITC (зелена) или TRITC (црвена).
| Комплет филтри | Филтер за возбудување | Дихроично огледало | Филтер за бариери | LED светилка Должина на бранот |
| FITC | БП460-495 | DM505 | БА510-550 | 485 nm |
| ДАПИ | BP360-390 | DM415 | БА435-485 | 365 nm |
| TRITC | БП528-553 | DM565 | БА578-633 | 535 nm |
| FL-Аурамин | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Тексас црвено | BP540-580 | DM595 | БА600-660 | 560 nm |
| mCherry | БП542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Како да изберете флуоресцентен филтер?
1. Принципот на избор на флуоресцентен филтер е да се остави светлината флуоресценција/емисија да помине низ крајот на сликата колку што е можно повеќе и целосно да ја блокира светлината за возбудување во исто време, за да се добие највисокиот сооднос сигнал-шум.Особено за примена на мултифотонско возбудување и микроскоп за вкупен внатрешен рефлексија, слабиот шум исто така ќе предизвика големи пречки во ефектот на сликање, така што барањето за однос сигнал кон шум е поголем.
2. Знајте го ексцитацискиот и емисиониот спектар на флуорофорот.За да се конструира сет на флуоресцентни филтри што генерира висококвалитетна слика со висок контраст со црна позадина, филтрите за возбудување и емисија треба да постигнат висок пренос со минимално бранување на проодната лента над регионите што одговараат на врвовите или емисиите на флуорофор возбудување.
3. Размислете за издржливоста на флуоресцентните филтри.Овие филтри мора да бидат непропустливи за интензивни извори на светлина кои генерираат ултравиолетова (УВ) светлина што може да доведе до „прегорување“, особено на филтерот за возбудување бидејќи е подложен на целосниот интензитет на изворот на осветлување.
Различните флуоресцентни примероци на слики
Ресурсите се собираат и организираат на Интернет, а се користат само за учење и комуникација.Ако има некакво прекршување, ве молиме контактирајте не за да го избришете.
Време на објавување: Декември-09-2022 година